Pemeriksaan Jamur

MYCOLOGI

Pengambilan Sampel

Kuku

-       Disiapkan pisau scalpel dan gunting kuku steril.

-       Dibersihkan kuku dengan kapas beralkohol, dibiarkan kering.

-       Sementara kuku mengering, disiapkan media yang digunakan.

-       Ditulis no.lab., nama pasien, dan tanggal pengambilan sampel.

-       Digunakan cawan petri steril untuk menampung potongan dan kerokan kuku.

-       Dipotong kuku dengan gunting kuku. Diusahakan potongan kuku agak besar, untuk direndam dalam KOH  Parker Blue 20%.

-       Sisa potongan kuku dikerok dengan pisau scalpel untuk ditanam dalam media yang sudah disiapkan.

Kulit

-       Disiapkan pisau scalpel steril.

-       Dibersihkan kulit yang akan dikerok dengan kapas beralkohol, dibiarkan mengering.

-       Sementara kulit mengering, disiapkan media yang akan digunakan.

-       Ditulis no.lab., nama pasien, dan tanggal pengambilan sampel.

-       Dikerok bagian kulit yang terinfeksi.

-       Kerokan yang sudah terkumpul sebagian ditabur (ditanam) dalam media yang sudah disiapkan, sebagian dibuat preparat KOH.

Rambut

-       Cara pengambilan sampel dari kepala sama dengan pengambilan sampel dari kulit. Hanya ditambah dengan akar rambut, karena biasanya terdapat spora pada akar rambut (endotriks ataupun eksotriks).

-       Pengolahan Sampel

     Dalam Pengolahan sampel pasien, hanya sampel kuku yang harus diolah. Cara pengolahan :

1.     Sampel kuku dikerik.

2.     Sampel kuku yang agak besar direndam dalam larutan KOH Parker Blue 20% (2-3 tetes) dan disimpan selama 1 malam dalam suhu/temperatur ruangan.

Pemeriksaan Sampel

- Preparat KOH

Kuku

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Diambil 1-2 Ose sampel kuku yang telah direndam dalam KOH Parker Blue 20% dan oleskan di atas object glass. Diusahakan agar mendapatkan kuku yang berbentuk seperti bubur.

3.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

4.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Kulit

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Kerokan kulit dikumpulkan dibagian tengah object glass.

3.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

4.         Dengan menggunakan cover glass, dicampurkan kerokan kulit dengan larutan tadi dengan ditutup dengan cover glasstadi.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Rambut

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Rambut dan kerokan kulit kepala dikumpulkan dibagian tengah object glass.

3.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

4.         Dengan menggunakan cover glass, dicampurkan rambut dan kerokan kulit dengan larutan tadi dengan ditutup dengan cover glass tadi.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Sputum, Pus, Urine, Liquor, Biopsi, dll.

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

3.         Diambil 1 ose sampel, disuspensikan dengan larutan KOH Parker Blue 20% tadi.

4.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Sekret, Sampel Swab

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Dioleskan sampel sekret / sampel swab ke atas object glass, dicampurkan dengan 1-2 tetes larutan KOH Parker Blue 20%.

3.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

4.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

- Kultur

Kuku

1.    Sampel kuku yang telah dikerik masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu / temperatur ruangan (25 - 30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Kulit

1.    Sampel kerokan kulit masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu / temperatur ruangan (25 - 30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Rambut

1.    Sampel rambut dan kerokan kulit kepala masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Minyak Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu/temperatur ruangan (25-30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Sekret/Sampel Swab

 Langsung dihapuskan pada media yang sudah disiapkan. Dibuat preparat sisanya.

Sputum, Pus, Darah, dll.

1.    Ditanam dengan cara digores menggunakan ose steril, sisanya dibuat preparat KOH Parker Blue 20%.

2.    Untuk sampel darah, diusahakan mendapat 2 bagian. 1 bagian ditambah Anti coagulant untuk dibuat preparat dan 1 bagian darah segar untuk biakan (kultur)

- Preparat Lacto-Phenol Cotton Blue

1.    Didalam safety cabinet, ditandai koloni tersangka yang tumbuh pada media.

2.    Disiapkan object glass bersih dan steril, ditulis nomor pemeriksaan dipinggirnya.

3.    Diteteskan 1 tetes larutan Lacto-Phenol Cotton Blue ke atas object glass.

4.    Diambil koloni tersangka dengan ose lurus / jarum tusuk.

5.    Disuspensikan dengan larutan Lacto-Phenol Cotton Blue.

6.    Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

7.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

- Subkultur

1.    Disiapkan media SBRD Agar / Rice Medium (jamur tertentu), diberi no. Lab dan tanggal.

2.    Pada safety cabinet, diambil sedikit koloni tersangka dan tanam pada media SBRD Agar / Rice Medium yang tadi sudah disiapkan.

3.    Diinkubasi pada suhu 35-37°C.

- Tes Fermentasi Gula-gula

1.    Disiapkan larutan glukosa, maltosa, sakarosa, dan urea slant dan plate yang terdapat koloni tersangka golongan Candida / Yeast.

2.    Diambil sedikit koloni dengan ose lurus / tusuk dan disuspensikan kedalam larutan-larutan tadi.

3.    Dibakar kembali ose lurus / tusuk yang telah digunakan.

4.    Disimpan dalam inkubator dengan temperatur 35-37^oC selama 24-72 jam. Diamati perubahan warna menjadi rose dan pembentukan gas pada tabung Durham (pembentukan gas baik pada hari ketiga), kemudian disesuaikan dengan Tabel Identifikasi Spesies Candida.

 *tes fermentasi gula-gula terhadap C.albicans

- Germ Tube Test

1.    Disiapkan cawan petri steril, batang Z/N, object glass dan cover glass bersih dan steril, serta serum kelinci.

2.    Disimpan batang Z/N kedalam cawan petri, ditaruh object glass diatasnya.

3.    Diteteskan 1-2 tetes serum kelinci yang sehat pada object glass.

4.    Diambil sedikit koloni dengan menggunakan ose mata/bulat steril.

5.    Disuspensikan dengan serum kelinci tadi dan ditutup dengan cover glass.

6.    Diberi air atau aquadest steril didasar cawan tersebut agar tidak kering saat diinkubasi.

7.    Disimpan dalam inkubator dengan temperatur 35-37^oC selama 2-4 jam.

8.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

 *Germ tube test C.albicans

- Slide Culture

1.    Disiapkan cawan petri steril, batang Z/N, object glass dan cover glass bersih dan steril, 1x1 cm media SBRD Agar, dan koloni jamur golongan Moulds.

2.    Disimpan batang Z/N kedalam cawan petri, ditaruh object glass diatasnya.

3.    Ditaruh media SBRD Agar ukuran 1x1 cm diatas object glass tersebut.

4.    Dengan jarum tusuk, diambil sedikit jamur (diambil sampai ke akarnya), lalu oles rata dipinggir-pinggir media SBRD Agar tadi.

5.    Media yang sudah diolesi tadi ditutup dengan cover glass.

6.    Diberi air atau aquadest steril didasar cawan tersebut agar tidak kering saat diinkubasi.

7.    Disimpan di suhu ruangan selama 2-3 hari.

8.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Sabouraud Dextrose Agar (SDA) sebagai media pertumbuhan jamur

      Sabouraud Dextrose Agar (SDA) adalah media selektif terutama digunakan untuk isolasi dermatophyta, jamur lain dan ragi, tetapi juga dapat tumbuh bakteri berserabut seperti Nocardia. PH asam dari media ini (pH sekitar 5,0) menghambat pertumbuhan bakteri tetapi memungkinkan pertumbuhan ragi dan kebanyakan jamur berfilamen. agen antibakteri juga dapat ditambahkan untuk meningkatkan efek antibakteri. Media ini juga digunakan untuk menentukan evaluasi mikologi makanan, kontaminasi dalam kosmetik dan klinis untuk membantu dalam diagnosis infeksi ragi dan jamur. SDA media terdiri dari enzimatik digest kasein dan jaringan hewan yang menyediakan sumber nutrisi asam amino dan senyawa nitrogen untuk pertumbuhan jamur dan ragi. Dextrose adalah karbohidrat difermentasi tergabung dalam konsentrasi tinggi sebagai sumber karbon dan energi. Agar adalah agen pemadat. Selain antibiotik seperti kloramfenikol dan / atau tetrasiklin bertindak antimikrobial spektrum sebagai luas untuk menghambat pertumbuhan berbagai bakteri gram positif dan gram negatif. Gentamisin ditambahkan untuk lebih menghambat pertumbuhan bakteri gram negatif. (Nisha Rijal, 2015)
Alat dan Bahan :

1. Alat :
   • Autoklaf
   • Petridish
   • Gelas ukur
   • Neraca analitik digital
   • Spatula
   • Kertas saring
   • Erlenmeyer
   • Kawat kasa
   • Kompor
   • Batang pengaduk
   • Alumunium foil
   • Kapas steril
   • Kertas dan kantung plastik
   • Kertas Label, Alat tulis
2. Bahan :
   • Nutrient agar
   • Saboraoud 4% dextrose agar
   • Aquades
   • Desinfektan (wipol)
   • Burner
   • Cara Kerja 
   1. Lakukan persiapan alat dan bahan yang diperlukan dalam pembuatan media nutrient agar dan saboraud dextrose agar. Bungkus petridish dengan kertas secara rapat serta masukkan ke dalam kantung plastik.
   2. Lakukan penimbangan  saboraud 4% dextrose agar 
   3. dengan rumus : M1V1 = M2V2
   3. Dituang agar yang telah ditimbang ke masing-masing erlenmeyer dan diberi pelabelan dengan format nama agar, tanggal pembuatan dan nama kelompok praktikan.
   4. Lakukan pengukuran volume aquadest yang akan digunakan dengan gelas ukur, kemudian dituang ke masing-masing Erlenmeyer.
   5. Homogenisasikan antara agar dan aquadest dengan cara memanaskan Erlenmeyer diatas kompor sambil diaduk dengan batang pengaduk hingga mendidih.
   6. Tutup masing-masing mulut Erlenmeyer dengan kapas steril dan alumunium foil, ikat dengan karet. Pastikan tertutup rapat untuk menghindari kontaminasi media dari zat atau bahan kontaminan yang masuk.
   7. Lakukan sterilisasi pada semua alat gelas yang akan digunakan dalam pembuatan media serta masukkan juga media yang telah dibuat tadi ke dalam autoklaf. Lakukan sterilisasi dengan suhu 121 oC, tekanan 1 atm selama 15 menit.
   8. Dinginkan alat gelas dan media di dalam Erlenmeyer pada suhu ruang.
   9. Hidupkan burner, lakukan fiksasi pada area pinggir petridish untuk menciptakan suasana steril. Tuang media yang ada di dalam Erlenmeyer ke masing-masing petridish. Beri pelabelan nama media. Kemudian lakukan fiksasi kembali pada areal pinggir petridish.
   10. Perhatikan ! Saat menuang cairan agar, hindari membuka cawan petri terlalu lebar untuk menghindari kontaminan yang mungkin masuk. lakukan fiksasi setiap membuka dan menutup cawan petri untuk menghindari kontaminasi pada media. Lakukan desinfeksi ruangan, meja dan alat yang digunakan setiap pembuatan media.
   11. Masukkan ke incubator, untuk menguji keberhasilan dan sterilitas pembuatan media baik nutrient agar maupun saboraud 4% dextrose agar pada suhu 37,0 oC selama 24 jam

STERILISASI

Sterilisasi dalam mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua organisme yang terdapat pada atau di dalam suatu benda. Ketika untuk pertama kalinya melakukan pemindahan biakan bakteri secara aseptik, sesungguhnya hal itu telah menggunakan salah satu cara sterilisasi, yaitu pembakaran. Namun, kebanyakan peralatan dan media yang umum dipakai di dalam pekerjaan mikrobiologi akan menjadi rusak bila dibakar. Ada tiga cara utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas, bahan kimia, dan penyaringan atau filtrasi 

Sterilisasi yang baik dapat mencegah tumbuhnya mikroba lain yang tidak diharapkan dalam bahan yang telah disterilisasi. Teknik sterilisasi yang digunakan berbeda antara satu dengan lainnya, tergantung dari jenis material yang digunakan. Alat-alat yang digunakan dalam praktikum mikrobiologi juga harus dalam keadaan steril atau bebas dari kuman serta bakteri, virus dan jamur. Dan untuk mensterilkannya diperlukan pula pengetahuan tentang cara-cara dan teknik sterilisasi. Hal ini dilakukan karena alat- alat yang digunakan pada laboratorium mikrobiologi memiliki teknik sterilisasi yang berbeda 

Steril merupakan syarat mutlak keberhasilan kerja dalam laboratorium mikrobiologi. Dalam melakukan sterilisasi, diperlukan teknik-teknik agar sterilisasi dapat dilakukan secara sempurna, dalam arti tidak ada mikroorganisme lain yang  mengkontaminasi media. Ada beberapa teknik sterilisasi, yaitu dengan cara fisikdengan panas, mekanik dengan filtrasi dan kimia dengan senyawa-senyawa kimia. Pembersihan benda-benda atau permukaan tubuh akan mengurangi jumlah mikroba sehingga memperkecil kemungkinan terjadinya infeksi. Misalnya cuci tangan dengan sabun dan bilas dengan air mengalir sebelum mengoperasikan 

Pada pengerjaan mikrobiologi, diperlukan suatu kondisi yang benar-benar aseptik dimana alat penunjang serta nutrient dan substrat harus benar-benar steril. Hal ini berarti mikroba kontaminan harus dimatikan. Sterilisasi dilakukan pada suhu 121oC selama 30 menit, yaitu agar spora atau mikroba dapat dimatikan. Spora adalah sel istirahat yang resisitan terhadap panas dan lingkungan yang berfungsi sebagai tunas untuk berkembang biak selanjutnya. Udara tekan yang digunakan juga harus dalam kondisi steril. Substrat yang berisi nutrien tidak peka terhadap suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan pada 138oC selama 5 menit. Pada substrat yang berisi nutrien tetapi peka terhadap suhu, maka sterilisasi media substrat dilakukan dengan penyaringan bertekanan melalui saringan milipore diameter 0,22 µm

Beberapa faktor-faktor yang mempengaruhi sterilisasi ini termasuk kelembaban, konsentrasi gas, suhu dan distribusi gas dalam chamber pengesterilan. Penghancuran bakteri tergantung pada adanya kelembaban, gas dan suhu dalam bahan pengemas, penetrasi melalui bahan pengemas, pada pengemas pertama atau kedua, harus dilakukan, persyaratan desain khusus pada bahan pengemas

sterilisasi alat-alat laboratorium hanya digunakan dua metode sterilisasi yaitu :

a.    Sterilisasi basah

Sterilisasi basah adalah metode sterilisasi dengan uap air bertekanan. Alat yang digunakan ketika sterilisasi dengan metode ini menggunakan autoklaf manual dan autoklaf elektrik. Prinsip kerja dari alat ini cukup sederhana.

1.     Autoklaf diisi dengan air secukupnya dan semua alat-alat yang akan disterilkan seperti tabung reaksi, spoid, labu erlemeyer, ose, dimasukkan kedalamnya.

2.    Sebelum ditutup, semua alat perlu disusun dengan baik untuk menghindari alat-alat gelas pecah sewaktu proses sterilisasi berlangsung yang disebabkan oleh tekanan dari uap air.

3.    Proses berikutnya adalah menutup autoklaf dengan memutar setiap sekrup dari arah berlawanan dengan kuat hingga tidak terdapat lagi celah untuk keluarnya uap air yang dihasilkan saat pemanasan berlangsung.

4.    Langkah terakhir adalah memanaskan autoklaf tersebut dengan nyala api hingga menghasilkan uap air jenuh bertekanan pada suhu 121oC selama 15 menit. 

5.    Setelah selesai autoklaf didiamkan terlebih dahulu beberapa menit. Apabila autoklaf telah dingin, sekrup dan baut pengunci dapat dibuka dan semua alat-alat yang sudah steril dapat dikeluarkan satu persatu.

6.    Adapun untuk sterilisasi menggunakan autoklaf elektrik terlebih dahulu air dengan takaran yang telah ditentukan dimasukkan kedalamnya kemudian alat-alat yang akan disterilkan seperti labu Erlemeyer dan gelas ukur. Suhu, tekanan, dan waktu yang dibutuhkan diseting sesuai kebutuhan.

7.    Biasanya proses sterilisasi menggunakan autoklaf elektrik berlangsung sekitar 15 menit dengan suhu 121 0C.

8.    Sterilisasi basah dapat digunakan untuk mensterilkan bahan apa saja yang dapat ditembus uap air dan tidak rusak bila dipanaskan dengan suhu yang berkisar antara 110 oC dan 121 oC.

b.    Sterilisasi kering

Sterilisasi kering merupakan sterilisasi dengan udara panas. Alat yang digunakan adalah oven. Cara ini umum dilakukan untuk mensterilkan peralatan gelas seperti cawan petri, tabung reaksi, dan alat-alat gelas lainnya. 

Prinsip kerja dari alat ini lebih sederhana yaitu pintu oven dibuka dan semua alat-alat yang akan disterilkan disusun rapi. Setelah itu pintu oven ditutup, suhu diseting pada angka 160-180oC selama 1-2 jam. Keuntungan dari pemanasan kering adalah tidak adanya uap air yang membasahi bahan atau alat yang disterilkan.