METODE
PERHITUNGAN CAWAN
PRINSIP HITUNGAN CAWAN
Metode
yanag dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroba didalam bahan pangan
terdiri dari metode hitungan cawan, “Most Propable Number” (MPN), dan metode
hitungan mikroskopik langsung. Dari metode-metode tersebut, metode hitungan
cawan yang paling banyak digunakan. Metode lainnya yang dapat digunakan untuk
menghitung jumlah mikroba didalam suatu larutan adalah metode turbidimetri(kekeruhan)
mengunakan spektrofotometer. Tetapi metode ini sukar diterapkan pada bahan
pangan karena medium yang diukur harus bening, sedangkan estrak bahan pangan,
misalnya sari buah, biasanya mengandung kompone-komponen yang menyebabkan
kekeruhan, sehingga kekeruhan larutan tidak sebanding dengan jumlah mikroba yang
terdapat didalamnya.
Pengenceran
Bahan pangan yang diperkirakan
mengandung lebih dari 300 sel mikroba per ml, per g, atau per cm permukaan
memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar dalam
cawan petri ,sehinga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut
dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah di antara
30 dan 300. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal yaitu 1:10, 1:100,
1:1000, dan seterusnya, atau 1:100, 1:10000, 1:1000000 dan
Gambar
4.1 (a) contoh cara pengenceran bahan
padat menggunakan pengenceran 1:10, dan
(b) Contoh cara pengenceran bahan cair menggunakan pengenceran 1:100
Pengambilan
contoh dilakukan secara aseptip dan pada setiap penegnceran dilakukan
pengocokan kira-kira sebanyak kali untuk memisahkan sel-sel mikroba yang
bergabung menjadi satu. Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan
jumlah koloni, sedangkan pengenceran yang bukan secara desimal, misalnya 1:5,
1:25, dan seterusnya jarang dilakukan karena tidak praktis dalam
perhitungannya. Untuk mengetahui jumlah mikroba pada permukaan luar bahan pangan, misanya daging
sapi, ayam atau ikan, pengambilan contoh dapat dilakukan menggunakan metode
usap (swab).
Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa
larutan fosfat buffer, larutan garam fisiologi 0,85%, atau larutan Ringer.
Untuk bahan pangan yang sukar larut, kedalam larutan pengencer pertama dapat
ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas (glass beads) yang
disterilisasi bersama dengan larutqan pengencer tersebut. Misalnya
jika contoh yang akan dianalisis adalah tepung atau pati, digunakan satu sendok
pasir kedalam 90 atau 99 mllarutan pengencer pertama, sehingga sewaktu dikocok pemecahan partikel-partikel tepung atau pati
akan lebih mudah butir-butir gelas digunakan jika akan menganalisis total
mikroba dari telur, sehingga bagian yang bersifat koloid pada telur dapat lebih
mudah dipecahkan.
Cara Pemupukan
Prinsip metode perhitungan cawan adalah sebagai
berikut: Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka
sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat
dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop. Metode hitungan cawan
merupakan yang paling sensitif untuk
menghitung jumlah mikroba karena alas an-alasan sebagai berikut.
(1) Hanya
sel yang masih hidup dihitung
(2) Beberapa
jenis mikroba dapat dihitung sekaligus
(3) Dapat
digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroba karena koloni yang terbentuk
mungkin berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan pertumbuhan spesifik.
Selain keuntungan-keuntungan
tersebut, metode hitungan cawan juga mempunyai kelemahan-kelemahan sebagai
berikut.
(1)
Hasil perhitungan tidak menunjukkan
jumlah sel mikroba yang sebenarnya, Karena beberapa sel yang berdekatan mungkin
membentuk satu koloni.
(2)
Medium dan kondisi yang berbeda mungkin
menghasilkan nilai yang berbeda.
(3)
Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat
tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak
menyebar.
(4)
Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi
beberapa hari sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung.
Metode hitungan
cawan dapat dibedakan atas dua cara yaitu: (1) Metode tuang (pour plate), dan
(2) Metode permukaan (surface spread plate).
(1)
Metode
Tuang (pour plate)
Dari pengenceran yang dikendaki, sebanyak 1 ml
atau 0.1 ml larutan tersebut (lihat gambar 4.1) dipipet kedalam cawan petri
menggunakan pipet 1 ml atau 1.1 ml. sebaiknya waktu antara dimulainya
pengenceran sampai menuangkan kedalam cawan petri tidak boleh lebih lama dari
30 menit.
Kemudian kedalam cawan tersebut dimasukkan
agar cair steril yang telah didinginkan sampai 50 0C sebanyak
kira-kira 15 ml. Selama penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka
terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. Segera setelah
penuangan, cawan petri digerakkan diatas meja secara hati-hati untuk
menyebarkan sel-sel mikroba secara merata, yaitu dengan gerakaqn melingkar atau
gerakan seperti angka delapan, setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat
diinkubasikan didalam incubator dengan posisi terbalik.
Inkubasi dilakukan pada suhu dan
waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroba yang akan dihitung. Medium agar yang
digunakan juga disesuaikan dengan dengan jenis mikroba yang akar ditumbuhkan.
Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup akar tumbuh dan membentuk koloni yang
dapat terlihat langsung oleh mata.
Setelah akhir masa inkubasi, koloni
yang berbentuk dihitung. Setiap koloni Setiap koloni dapat dianggap berasal
dari satu sel yang membela menjadi banyak sel, meskipun mungkin juga berasal
dari satu sel yang letaknya berdekatan. Perhitungan jumlah koloni dapat
dilakukan menggunakan “Quebec Colony
Counter”. Ketelitian akan lebih tinggi jika dilakukan pemupukan secara
duplo, yaitu menggunakan dua cawan petri untuk setiap pengenceran.
(2)
Metode
Permukaan (Surface/Pour Plate)
Pada pemupukan
dengan metode permukaan, agar steril terlebih dahulu dituangkan kedalam cawan
petri steril dan dibiarkan membeku. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian
sebanyak 0.1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar
tersebut. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan kedalam
alcohol 95% dan dipijarkan sehingga alcohol habis terbakar. Setelah dingin,
batang gelas tersebut digunakan untuk meratakan contoh diatas medium agar
dengan cara memutarkan cawan petri
diatas meja. Selanjutnya inkubasi dilakukan seperti pada metode tuang. Tetapi
harus diingat bahywa jumlah contoh yang ditumbuhkan hanya 0.1 ml, tidak boleh 1
ml, jadi harus dimasukkan kedalam perhitungan pengenceran untuk mendapatkan
“Total Count”.
Cara
Menghitung Koloni
Perhitungan
jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran dilakukan secara
decimal. Sebagai contoh misalnya penetapan jumlah mikroba susu. Pengenceran
awal 1:10 (=10-1) dibuat dengan cara mengencerkan 1 ml susu kedalam
9 ml larutan pengencer, dilanjutkan dengan pengenceran yang lebih tinggi
misalnya sampai 10-5 atau 10-6, tergantung pada mutu
susunya. Semakin tinggi jumlah mikroba yang terdapat didalam susu, semakin
tinggi pengenceran yang harus dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya
diperoleh 60 dan 64 koloni masing-masing pada cawan duplo yang mengandung
pengenceran 10-4, maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut
(1 ml larutan pengenceran dianggap mempunyai berat 1 kg):
Faktor
pengenceran = Pengenceran
x Jumlah yang ditumbuhkan.
= 10-4 x
1.0
= 10-4
Jumlah
koloni = Jumlah koloni x
1/Faktor Pengenceran per ` ` cawan
= (60
+ 64)/2 x
1/10-4
= 6.2 x 105
STANDAR
PERHITUNGAN
Untuk suatu
hasil analisis mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut “Standard
Plate Count” (SPC), yang menjelaskan mengenai cara menghitung koloni pada cawan
serta cara memiliki data yang ada menghitung jumlah koloni didalam suatu
contoh,,
Cara menghitung koloni pada
cawan adalah sebagai berikut:
1.
Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang
mengandung jumlah koloni anatara 30 dan 300.
2.
Bebearapa koloni bergabung menjadi satu
merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan,
dapat dihitung sebagai satu koloni.
3.
Suatu deretan (rantai) koloni yang
terlihat sebagai suatu garis tebal
dihitung sebagai satu koloni.
Data yang dilaporkan sebagai SPC harus
mengikuti peraturan-peraturan sebagai berikut:
1.
Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari
dua angka, yaitu angka petama didepan koma dan angka kedua dibelakang koma.
Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari 5, Harus dibulatkan
satu angka lebih tinggi pada angka yang kedua.
Jumlah
koloni “Standard
Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
10-2 10-3 10-4
|
234
|
|
125
|
|
197
|
TBUD
TBUD 2.0 x 106 TBUD>300
TBUD = Terlalu banyak untuk dihitung
2.
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk
pemupukan mengahasilkan angka kurang dari 30 koloni pada cawan petri, hanya
jumlah koloni pada pengenceran terendah yang dihitung. Hasilnya dilaporkan
nsebagai kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah
yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda kurung.
Jumlah koloni “Standard Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
10-2 10-3 10-4
|
16
|
1 0 <3.0 x 103 Hitung pengenceran
(1.6 x 103) 10-2
3.
Jika semua pengenceran yang dibuat untuk
pemupukan mengahasilkan lebih dari 300 koloni pada cawan petri, hanya jumlah
koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung, misanya dengan cara
menghitung jumlahnya pada 1/4 bagian cawan petri, kemudian hasilnya dikalikan
empat. Hasilnya dilaporkan sebagai lebih dari 300 dikalikan dengan besarnya
pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan dalam tanda
kurung.
Jumlah koloni “Standard Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
.10-2 10-3 10-4
|
355
|
TBUD TBUD >3.0 x 106 Hitung pengenceran
|
325
|
TBUD
20 >3.0 x
105 Hitung
Pengenceran
(3.3 x
105) 10-3
4.
Jika cawan dari dua tingkat pengenceran
menghasilkan koloni dari tingkat pengenceran menghasilkan koloni dengan jumlah
antara 30 dan 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah dari
kedua pengenceran tersebut lebih kecil atau sama dengan 2, tentukan rat-rata
dari kedua nilai tersebut dengan memperhitungkan pengencerannya. Jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah lebih besar dari 2, yang
dilaporkannya hanya hasil yang terkecil.
Jumlah koloni “Standard Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
.10-2 10-3 10-5
|
41
|
|
293
|
Karena
41000/29300
=
1.4 (<2)
|
140
|
102
karena 32000/
14000
= 2.3 (>2)
5.
Jika digunakan dua cawan petri (duplo) per
pengenceran, data yang diambil dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil
salah satu, meskipun salah satu dari cawan duplo tersebut tidak memenuhi syarat
diantara 30 dan 300.
Jumlah koloni “Standard Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
.10-2 10-3 10-4
|
175 208
|
16 1 1.9 x 104 Rata-rata dari
peng-
17
0 enceran
10-2
Jumlah koloni “Standard Plate Keterangan
Per pengenceran
Count”
.10-2 10-3 10-4
|
138 162
|
42 2 1.5 x 104 Rata-rata dari peng-
43 4 enceran
10-2 karena
Perbandingan
antara
Pengenceran
10-3 dan
10-4
adalah 2.4
|
290 280
|
|
36 32
|
4 3.1 x
104 Rata-rata dari peng-
1 Enceran 10-2 dan 10-3
Karena
perbandingan
Antara
kedua peng-
|
219 305
|
25 3 3.0 x
104 Rata-rata
dari peng-
27
0 enceran
10-2 meskipun
305>300
(angka yang
Yang
lain <30).
TOTAL MIKROBA BERDASARKAN KELOMPOK
Total mikroba
Prinsip hitungan cawan dapat digunakan
untuk menghitung jumlah mikroban didalam contoh, yaitu dengan menggunakan Plate Count Agar (PCA) sebagai
medium pemupukan.
PCA
adalah suatu medium yang mengandung 0.5% tripton, 0.25% estrak khamir
dan 0.1% glukosa sehingga semua mikroba termasuk bakteri, kapang dan khamir
dapat tumbuh dengan baik pada medium tersebut.
Total Bakteri
Untuk menghitung total bakteri dengan
metode hitungan total bekteri dengan metode hitungan cawan digunakan Nutrient
Agar (NA). NA adalah satu medium yang mengandung jsumber nitrogen dalam jumlah
cukup yaitu 0.3% ekstrak sapid an 0.5% pepton, tetapi tidak mengandung sumber
karbohidrat, oleh karena itu baik untuk pertumbuhan bakteri tetapi kapang dan
khamir tidak dapat tumbuh dengan baik.
Total Spore Bakteri
Untuk menghitung jumlah spora bakteri
pada contoh makanan, suspense contoh harus dipanaskan terlebih dahulu untuk membunuh
sel vegenatif bakteri, kapang dan khamir maupun spora kapang dan khamir. Jumlah
spora bakteri di dalam contoh dapat dihitung meggunakan metode hitungan cawan setelah
contoh dipanaskan pada suhu 80’C selama 10 menit. Jika yang akan dihitung hanya
spora yang tahanpanas (termoresistan), termasuktermofil, pemanasan dilakukan pada
suhu yang lebih tinggi yaitu 100’C selama 10 menit (Gambar 4.2). medium yang
digunakan untuk spora aerobic adalah Nutrient
Agar, sedangkan untuk spora anaerobic dapat digunakan Chopped Meat Medium (prereduced).
Khusus untuk menghitung jumlah spora
termofil aerobic penyebab busuk asam tanpa gas dan spora termofil anaerobic
pembentuk hydrogen sulfide dapat dilihat pada Bab 6 (Termofil).
Total Kapang Dan Khamir
Jumlah Kapang dan Khamir di dalam
contoh makanan dapat dihitung dengan metode hitungan cawan menggunakan medium
Potato Dextrose Agar (PDA). Jika di dalam contoh diduga mengandung juga bakteri
dalam jumlah tinggi,maka pertumbuhan bakteri dapat dihambat dengan menambahkan
asam tartarat 10% steril kedalam PDA setelah sterilisasi. Jumlah yang
ditambahkan biasanya adalah 1 ml asam tartarat 10% kedalam setiap 100 ml PDA
steril.
DA adalah suatu medium yang
mengandung sumber karbohidrat dalam jumlah cukup, yaitu terdiri dari 20%
ekstrak kentang dan 2% glukosa sehingga baik untuk pertumbuhan kapang dan
khamir tetapi kurang baik untuk pertumbuhan bakteri. Akan tetapi karena
beberapa bakteri juga menfementasi karbohidrat dan menggunakannya sebagai
sumber energy, maka beberapa bakteri masih mungkin tumbuh PDA. Dengan menurunkan
pH PDA menjadi kira–kira 3.5, pertumbuhan bakteri akan terhambat karena pada
umumnya bakteri tidak dapat tumbuh. Pada pH kurang 4.0. PDA yang
telahdiasamkantersebutdisebut Acidified Potato Dextrose Agar (APDA)
|
Mikroba
di dalam
Contoh
Pemanasan
80’ . 10 menit
Pemanasan
100’. 10 menit
|
|
SporaBakteri
|
|
SporaTennoresistan
(termasuktermofil)
|
|
Sel vegetative
mati
|
|
Spora
termolabil
mati
|
Gambar 4.2 perlakuan pemanasan pada pengujian jumlah
spora bakteri
KOMPOSISI MEDIUM
Nutrient Agar (NA) : Ekstraksapi 3 g
Pepton 5 g
Gambar 4.2. Perlakuan pemanasan pada pengujian jumlah spora
bakteri
Komponen Agar (NA)
: Estrak sapi 3 g
Plate count Agar (PCA) :
Tripton 5 g
Ekstrakkhamir 1.5 g
Dekstrosa 1 g
Agar 15 g
Air destilata 1000ml
pH 7.0
Potato. Dextrosa
Agar :Infusi kentang 200 g
(PDA)
Deskstrosa 20 g
Agar 15 g
Air
destilasi 800ml
Acidified PDA (APDA): Komposisi seperti PDA, tetapi setelah
Sterilisasi, pHnya
diatur menjadi 3,5-4,0
Dengan larutan asam
tartrat 10%. Biasanya di butuhkan 1 ml larutan asam tartrat 10% dalam 100ml
PDA.
