Pemeriksaan Jamur

MYCOLOGI

Pengambilan Sampel

Kuku

-       Disiapkan pisau scalpel dan gunting kuku steril.

-       Dibersihkan kuku dengan kapas beralkohol, dibiarkan kering.

-       Sementara kuku mengering, disiapkan media yang digunakan.

-       Ditulis no.lab., nama pasien, dan tanggal pengambilan sampel.

-       Digunakan cawan petri steril untuk menampung potongan dan kerokan kuku.

-       Dipotong kuku dengan gunting kuku. Diusahakan potongan kuku agak besar, untuk direndam dalam KOH  Parker Blue 20%.

-       Sisa potongan kuku dikerok dengan pisau scalpel untuk ditanam dalam media yang sudah disiapkan.

Kulit

-       Disiapkan pisau scalpel steril.

-       Dibersihkan kulit yang akan dikerok dengan kapas beralkohol, dibiarkan mengering.

-       Sementara kulit mengering, disiapkan media yang akan digunakan.

-       Ditulis no.lab., nama pasien, dan tanggal pengambilan sampel.

-       Dikerok bagian kulit yang terinfeksi.

-       Kerokan yang sudah terkumpul sebagian ditabur (ditanam) dalam media yang sudah disiapkan, sebagian dibuat preparat KOH.

Rambut

-       Cara pengambilan sampel dari kepala sama dengan pengambilan sampel dari kulit. Hanya ditambah dengan akar rambut, karena biasanya terdapat spora pada akar rambut (endotriks ataupun eksotriks).

-       Pengolahan Sampel

     Dalam Pengolahan sampel pasien, hanya sampel kuku yang harus diolah. Cara pengolahan :

1.     Sampel kuku dikerik.

2.     Sampel kuku yang agak besar direndam dalam larutan KOH Parker Blue 20% (2-3 tetes) dan disimpan selama 1 malam dalam suhu/temperatur ruangan.

Pemeriksaan Sampel

- Preparat KOH

Kuku

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Diambil 1-2 Ose sampel kuku yang telah direndam dalam KOH Parker Blue 20% dan oleskan di atas object glass. Diusahakan agar mendapatkan kuku yang berbentuk seperti bubur.

3.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

4.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Kulit

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Kerokan kulit dikumpulkan dibagian tengah object glass.

3.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

4.         Dengan menggunakan cover glass, dicampurkan kerokan kulit dengan larutan tadi dengan ditutup dengan cover glasstadi.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Rambut

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Rambut dan kerokan kulit kepala dikumpulkan dibagian tengah object glass.

3.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

4.         Dengan menggunakan cover glass, dicampurkan rambut dan kerokan kulit dengan larutan tadi dengan ditutup dengan cover glass tadi.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Sputum, Pus, Urine, Liquor, Biopsi, dll.

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Diteteskan 1 tetes larutan KOH Parker Blue 20% dipinggirnya.

3.         Diambil 1 ose sampel, disuspensikan dengan larutan KOH Parker Blue 20% tadi.

4.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

5.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

Sekret, Sampel Swab

1.         Disiapkan object glass, diberi nomor lab. dipinggirnya.

2.         Dioleskan sampel sekret / sampel swab ke atas object glass, dicampurkan dengan 1-2 tetes larutan KOH Parker Blue 20%.

3.         Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

4.         Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

- Kultur

Kuku

1.    Sampel kuku yang telah dikerik masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu / temperatur ruangan (25 - 30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Kulit

1.    Sampel kerokan kulit masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu / temperatur ruangan (25 - 30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Rambut

1.    Sampel rambut dan kerokan kulit kepala masing-masing dimasukkan kedalam plate SBRC Minyak Agar dan Dermatophyte Test Medium (DTM).

2.    Dibungkus plate yang telah berisi isolat dari sampel  kuku dengan menggunakan kertas Non Woven Blue.

3.    Disimpan pada suhu/temperatur ruangan (25-30^oC) selama 1 bulan. Diamati perkembangan tiap 1 minggu.

Sekret/Sampel Swab

 Langsung dihapuskan pada media yang sudah disiapkan. Dibuat preparat sisanya.

Sputum, Pus, Darah, dll.

1.    Ditanam dengan cara digores menggunakan ose steril, sisanya dibuat preparat KOH Parker Blue 20%.

2.    Untuk sampel darah, diusahakan mendapat 2 bagian. 1 bagian ditambah Anti coagulant untuk dibuat preparat dan 1 bagian darah segar untuk biakan (kultur)

- Preparat Lacto-Phenol Cotton Blue

1.    Didalam safety cabinet, ditandai koloni tersangka yang tumbuh pada media.

2.    Disiapkan object glass bersih dan steril, ditulis nomor pemeriksaan dipinggirnya.

3.    Diteteskan 1 tetes larutan Lacto-Phenol Cotton Blue ke atas object glass.

4.    Diambil koloni tersangka dengan ose lurus / jarum tusuk.

5.    Disuspensikan dengan larutan Lacto-Phenol Cotton Blue.

6.    Ditutup dengan cover glass. Ditekan sedikit agar didapat preparat yang cukup tipis.

7.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

- Subkultur

1.    Disiapkan media SBRD Agar / Rice Medium (jamur tertentu), diberi no. Lab dan tanggal.

2.    Pada safety cabinet, diambil sedikit koloni tersangka dan tanam pada media SBRD Agar / Rice Medium yang tadi sudah disiapkan.

3.    Diinkubasi pada suhu 35-37°C.

- Tes Fermentasi Gula-gula

1.    Disiapkan larutan glukosa, maltosa, sakarosa, dan urea slant dan plate yang terdapat koloni tersangka golongan Candida / Yeast.

2.    Diambil sedikit koloni dengan ose lurus / tusuk dan disuspensikan kedalam larutan-larutan tadi.

3.    Dibakar kembali ose lurus / tusuk yang telah digunakan.

4.    Disimpan dalam inkubator dengan temperatur 35-37^oC selama 24-72 jam. Diamati perubahan warna menjadi rose dan pembentukan gas pada tabung Durham (pembentukan gas baik pada hari ketiga), kemudian disesuaikan dengan Tabel Identifikasi Spesies Candida.

 *tes fermentasi gula-gula terhadap C.albicans

- Germ Tube Test

1.    Disiapkan cawan petri steril, batang Z/N, object glass dan cover glass bersih dan steril, serta serum kelinci.

2.    Disimpan batang Z/N kedalam cawan petri, ditaruh object glass diatasnya.

3.    Diteteskan 1-2 tetes serum kelinci yang sehat pada object glass.

4.    Diambil sedikit koloni dengan menggunakan ose mata/bulat steril.

5.    Disuspensikan dengan serum kelinci tadi dan ditutup dengan cover glass.

6.    Diberi air atau aquadest steril didasar cawan tersebut agar tidak kering saat diinkubasi.

7.    Disimpan dalam inkubator dengan temperatur 35-37^oC selama 2-4 jam.

8.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

 *Germ tube test C.albicans

- Slide Culture

1.    Disiapkan cawan petri steril, batang Z/N, object glass dan cover glass bersih dan steril, 1x1 cm media SBRD Agar, dan koloni jamur golongan Moulds.

2.    Disimpan batang Z/N kedalam cawan petri, ditaruh object glass diatasnya.

3.    Ditaruh media SBRD Agar ukuran 1x1 cm diatas object glass tersebut.

4.    Dengan jarum tusuk, diambil sedikit jamur (diambil sampai ke akarnya), lalu oles rata dipinggir-pinggir media SBRD Agar tadi.

5.    Media yang sudah diolesi tadi ditutup dengan cover glass.

6.    Diberi air atau aquadest steril didasar cawan tersebut agar tidak kering saat diinkubasi.

7.    Disimpan di suhu ruangan selama 2-3 hari.

8.    Diperiksa dibawah mikroskop dengan perbesaran lensa okuler 10x dan lensa objektif 10x  atau dengan lensa objektif 40x.

TSIA - triple sugar iron agar

Triple Sugar Iron Agar (TSI): Principle, Procedure and Interpretation

Whenever you see the name of this test i.e. Triple Sugar Iron Agar ,you have to remember that it’s a test which has three sugar (Lactose, Sucrose, and Glucose) and also iron; and it contains Agar Agar as solidifying agent (TSI is a semi solid media having slant and butt).

CLUE: You might have (or not) realized the rationale behind the use of three different sugar and adding iron. Lets start with very basic information and we will proceed towards principle and interpretations.

Composition of Triple Sugar Iron Agar (TSI)
Lactose, Sucrose and Glucose in the concentration of 10:10:1 (i.e. 10 part Lactose (1%), 10 part Sucrose (1%) and 1 part Glucose (0.1%)). TSI is similar to Kligler’s iron agar (KIA), except that Kligler’s iron agar contains only two carbohydrates: glucose (0.1%) and lactose (1%).

• 0.1% Glucose: If only glucose is fermented, only enough acid is produced to turn the butt yellow.  The slant will remain red
• 1.0 % lactose/1.0% sucrose:  a large amount of acid turns both butt and slant yellow, thus indicating the ability of the culture to ferment either lactose or sucrose.
• Iron: Ferrous sulfate: Indicator of H2S formation
• Phenol red: Indicator of acidification (It is yellow in acidic condition and red under alkaline conditions).
• It also contains Peptone which acts as source of nitrogen. (Remember that when ever peptone is utilized under aerobic condition ammonia is produced)

Procedure for Triple Sugar Iron Agar (TSI) Test

1. With a sterilized straight inoculation needle touch the top of a well-isolated colony
2. Inoculate TSI Agar by first stabbing through the center of the medium to the bottom of the tube and then streaking on the surface of the agar slant. 
3. Leave the cap on loosely and incubate the tube at 35°C in ambient air for 18 to 24 hours.

Why Sucorse is added in TSI? 

Addition of sucrose in TSI Agar  permits  earlier detection of coliform bacteria that ferment sucrose more rapidly than lactose. Adding sucrose also aids the identification of certain gram-negative bacteria that could ferment sucrose but not lactose. Other basic understanding is TSI Tube contains butt (poorly oxygenated area on the bottom) slant (angled well oxygenated area on the top).

Interpretation of Triple Sugar Iron Agar Test

Inoculation in TSI Agar

1. If lactose (or sucrose) is fermented, a large amount of acid is produced, which turns the phenol red indicator yellow both in butt and in the slant. Some organisms generate gases, which produces bubbles/cracks on the medium.
2. If lactose is not fermented but the small amount of glucose is, the oxygen deficientbutt will be yellow (remember that butt comparatively have more glucose compared to slant i.e. more media more glucose), but on the slant the acid (less acid as media in slant is very less) will be oxidized to carbondioxide and water by the organism and the slant will be red (alkaline or neutral pH).
3. If neither lactose/sucrose nor glucose is fermented, both the butt and the slant will be red. The slant can become a deeper red-purple (more alkaline) as a result of production of ammonia from the oxidative deamination of amino acids (remember peoptone is a major constitutents of TSI Agar) .
4. if H2S is produced, the black color of ferrous sulfide is seen.

So the expected results of TSI Agar test are:

Triple Sugar Iron Agar Test Results
Image source: Clark College

1. Alkaline slant/no change in butt (K/NC) i.e Red/Red = glucose, lactose and sucrose non-fermenter
2. Alkaline slant/Alkaline butt (K/K) i.e Red/Red = glucose, lactose and sucrose non-fermenter
3. Alkaline slant/acidic butt (K/A); Red/Yellow = glucose fermentation only, gas (+ or -), H2s (+ or -)
4. Acidic slant/acidic butt (A/A); Yellow/Yellow = glucose, lactose and/or sucrose fermenter gas (+ or -), H2s (+ or -).

Some example of Triple Sugar Iron (TSI) Agar Reactions: 

Name of the organisms	Slant	Butt	Gas	H2S
Escherichia, Klebsiella, Enterobacter	Acid (A)	Acid (A)	Pos (+)	Neg (-)
Shigella, Serratia	Alkaline (K)	Acid (A)	Neg (-)	Neg (- )
Salmonella, Proteus	Alkaline (K)	Acid (A)	Pos (+)	Pos (+)
Pseudomonas	Alkaline (K)	Alkaline (K)	Neg (-)	Neg (-)