MEDIA UJI BIOKIMIA BAKTERI

Simmons Citrate Agar- Composition, Principle, Uses, Preparation and Result Interpretation

Simmons Citrate Agar is an agar medium used for the differentiation of Enterobacteriaceae based on the utilization of citrate as the sole source of carbon. 

In the early 1920s, Koser developed a liquid medium formulation for the differentiation of fecal coliforms from the coliform group. Simmons later modified this formulation to produce a solid medium that eliminated potential errors when interpreting growth.

Composition of Simmons Citrate Agar

Ingredients per liter of deionized water:*

Sodium Chloride (NaCl)	5.0 gm
Sodium Citrate (dehydrate)	2.0 gm
Ammonium Dihydrogen Phosphate	1.0 gm
Dipotassium Phosphate	1.0 gm
Magnesium Sulfate (heptahydrate)	0.2 gm
Bromothymol Blue	0.08 gm
Agar	15.0 gm

Deionized water = 1,000 ml
Final pH 6.9 +/- 0.2 at 25 degrees C.

Principle of Simmons Citrate Agar

Simmons Citrate agar is used to test an organism’s ability to utilize citrate as a source of energy. Ammonium Dihydrogen Phosphate is the sole source of nitrogen. Dipotassium Phosphate acts as a buffer. Sodium Chloride maintains the osmotic balance of the medium. Sodium Citrate is the sole source of carbon in this medium. Magnesium Sulfate is a cofactor for a variety of metabolic reactions. Bacteriological agar is the solidifying agent. Organisms capable of utilizing ammonium dihydrogen phosphate and citrate will grow unrestricted on this medium. If citrate can be used, the microbe will accumulate alkaline/basic byproducts.

Bacteria that can grow on this medium produce an enzyme, citrate-permease, capable of converting citrate to pyruvate. Pyruvate can then enter the organism’s metabolic cycle for the production of energy. Growth is indicative of utilization of citrate, an intermediate metabolite in the Krebs cycle.

When the bacteria metabolize citrate, the ammonium salts are broken down to ammonia, which increases alkalinity. The shift in pH turns the bromthymol blueindicator in the medium from green to blue above pH 7.6.

Uses of Simmons Citrate Agar

1. It is used for the differentiation of Gram-negative bacteria on the basis of citrate utilization.
2. Simmons Citrate Agar may be used to differentiate citrate-positive Salmonella enteritidis and members of Salmonella subgenus II, III and IV from the citrate-negative Salmonella typhi, Salmonella paratyphi A, Salmonella pullorum and Salmonella gallinarum.
3. Simmons Citrate Agar is primarily used to aid in the identification of Enterobacteriaceae. Uses
   include:

• Escherichia coli (usually -) and Shigella spp. (-) from other commonly encountered
  Enterobacteriaceae (variable +).
• Edwardsiella spp. (-) from Salmonella spp. (usually +)
• Serratia proteamaculans (+) from Yersinia pseudotuberculosis (-) and Yersinia enterocolitica
  (usually -)
• Klebsiella-Enterobacter groups (usually +) from E. coli (usually -)
• Proteus rettgeri (+) from Morganella morganii biogroups 1 and 2 (-)
• Yokenella regensburgei (+) from Hafnia alvei (-)
• Leminorella grimontii (+) from L. richardii (-)
• Acidovorax delafieldii (+) from A. facilis (-) and  A. temperans (-)

Preparation of Simmons Citrate Agar

1. Dissolve above salts in deionized water.
2. Adjust pH to 6.9.
3. Add agar and Bromothymol blue.
4. Gently heat, with mixing, to boiling until agar is dissolved.
5. The medium may be used either as slopes in test tubes or as a plate medium in petri dishes. In both cases the surface of the medium is lightly inoculated by streaking and, where slopes are used, the butt of medium is inoculated by stabbing.
6. For tubes, dispense 4.0 to 5.0 ml into 16-mm tubes.
7. Autoclave at 121 degree C under 15 psi pressure for 15 minutes.
8. Cool in slanted position (long slant, shallow butt).
9. Tubes should be stored in a refrigerator to ensure a shelf life of 6 to 8 weeks.
10. The uninoculated medium will be a deep forest green due to the pH of the sample and the bromothymol blue.

Result Interpretation on Simmons Citrate Agar

Positive growth (i.e. citrate utilisation) produces an alkaline reaction and changes the colour of the medium from green to bright blue.
Examples: Serratia and the majority of the Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus and Providencia species, except Morganella morganii and Klebsiella rhinoscleromatis.

Negative test (i.e. no citrate utilisation) the colour of the medium remains unchanged.
Examples: Escherichia coli, Shigella, Yersinia, Edwardsiella species, etc.

Limitations of Simmons Citrate Agar

1. It is important not to carry over any nutrients into the citrate medium because this will result in false positive tests.
2. Some organisms are capable of growth on citrate and do not produce a color change. Growth is considered a positive citrate utilization test, even in the absence of a color change.
3. Tests with equivocal results should be repeated.
4. The reactions of this medium alone are not sufficient for identification to the species level.
5. The inoculum should be from a pure, overnight culture grown on a solid medium and not from a broth suspension.

Quality Control on Simmons Citrate Agar

Positive control: Klebsiella pneumoniae ATCC® 13883. Growth; colour change of medium to blue 
Negative control: Escherichia coli ATCC® 25922. Inhibited or no growth; no colour change of medium

References

1. Thermo Fisher Scientific Inc., Dehydrated Culture Media- SIMMONS CITRATE AGAR.
2. Sisco Research Laboratories Pvt. Ltd.- Simmon’s Citrate Agar (59437).
3. Austin Community College.
4. Hardy Diagnostics- SIMMONS CITRATE AGAR (L80).
5. Intuitive Systems, Inc.- Simmons’ Citrate Agar Slant.
6. Scharlab- Simmons Citrate Agar (01-177).
7. Merck Microbiology Manual 12th Edition- SIMMONS Citrate Agar.
8. Dalynn Biologicals- SIMMONS CITRATE AGAR (TS62).
9. Remel- Citrate Agar (Simmons).
10. Conda Lab- SIMMONS CITRATE AGAR ISO 10273 (1014).
11. Sigma-Aldrich, Inc.- SIMMONS CITRATE AGAR (S3681).
12. HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.- Simmons Citrate Agar (M099).
13. Acumedia Manufacturers, Inc.- SIMMONS CITRATE AGAR (7156).

TUGAS PENDAHULUAN

1. JELASKANLAH PRINSIP HITUNG CAWANG UNTUK ANGKA LEMPENG TOTAL
2. JELASKAN,APAKAH PERBEDAAN MENGGUNAKAN PCA DAN NA SEBAGAI MEDIA YANG DIGUNAKAN UNTUK HITUNG ANGKA LEMPENG TOTAL ?
3. JELASKAN CARA MENGHITUNG TOTAL SPORA BAKTERI PADA MAKANAN

4. MENGAPA UNTUK MENGHITUNG SPORA BAKTERI HARUS DILAKUKAN PEMANASAN?
5. BERAPAKAH SUHU YANG DIGUNAKAN UNTUK PEMANASAN SPORA BAKTERI?
6. JELASKANLAH CARA MENGHITUNG TOTAL KAPANG DAN KHAMIR PADA MAKANAN

PENGAMBILAN, PENANGANAN DAN PENGIRIMAN SAMPEL PEMERIKSAAN AIR

Pengambilan, Penanganan, dan Pengiriman Spesimen

Pengambilan specimen air harus dilakukan secara steril guna memastikan tidak terdapatnya organisme yang mengkontaminasi.

Sampel air dapat berasal dari: Air kran, air sumur, sumber air yang terbuka seperti air danau atau sungai.

            Cara pengambilan specimen :

1.      Air keran

a.       Bersihkan kran dari setiap benda yang menempel yang mungkin dapat menganggu, dengan kain bersih, bersihkan ujung kran dari setiap kotoran atau debu.
b.      Putar sampai kran terbuka sehingga air mengalir secara maksimal dan biarkan air mengalir selama 1-2 menit.
c.       Mulut kran disterilkan dengan cara membakar dengan lidi kapas yang telah dicelupkan dalam ethanol 70% atau dengan menggunakan pembakar dari gas.
d.      Buka tali pengikat dan kertas pembungkus botol.
e.       Buka tutup botol dengan tangan kiri, botol dipegang dengan tangan kanan. Untuk mencegah masuknya debu yang mungkin mengandung mikroorganisme, penutup dipegang dengan muka menghadap ke bawah.
f.       Sambil memegang penutup, air kran ditampung hingga ¾ bagian botol. Diisi hanya ¾ bagian botol (dengan menyisakan udara diatasnya) dengan maksud agar air dapat dikocok sebelum dianalisa.
g.      Tutup botol dengan hati-hati.
h.      Kemudian bagian tutupnya dibungkus dengan kertas steril tadi.
i.        Sekeliling leher botol diikat dengan tali. Kemudian pada botol diberi label dan catat suhu air tersebut.

2.      Air sumur

a.       Buka bungkus botol yang telah steril, bilas tangan dengan ethanol 70%, kemudian buka tutup botol dan letakkan di atas bungkus yang steril tadi.
b.      Dengan posisi mulut botol menghadap ke atas, ulurkan botol tersebut ke dalam sumur secara perlahan-lahan, jangan sampai botol tersebut menyentuh dinding sumur. Celupkan seluruh permukaan botol ke dalam air sumur hingga mencapai dasar.
c.       Tarik botol yang telah terisi penuh dengan air secara perlahan-lahan, buang ¼ bagian dari air yang ada dalam botol tersebut.
d.      Tutup kembali botol tersebut, bungkus dengan kertas steril tadi dan ikat dengan tali pada bagian leher botol. Kemudian beri label.

3.      Air dari sumber air yang terbuka seperti: danau, sungai, dll

a.       Botol dipegang pada bagian bawah, celupkan ke dalam air dengan leher botol menghadap miring ke bawah, celupkan botol tersebut hingga mencapai kedalaman ± 20 cm.
b.      Kemudian angkat botol tersebut dalam air dengan mulut botol menghadap ke atas. Bila perlu mulut botol berhadapan dengan arah aliran air.
c.      Setelah botol terisi air, tutup kembali botol dengan kertas pembungkus dan ikat dengan tali pada bagian leher botol tersebut. Kemudian beri label.

Cara penanganan dan pengiriman specimen:

Pengiriman specimen dilaksanakan secepetanya dalam waktu kurang dari 24 jam. Sebelum dikirim, sampel air disimpan dalam refrigerator. Bila perjalanan diperkirakan akan memakan waktu lebih dari 3 jam, specimen harus dikirim dalam suasanan dingin, pada suhu 4-10˚C. sampel air yang akan dikirim harus dikemas terlebih dahulu.

Botol dipak dalam kotak kayu yang telah diberi tanda: ATAS dan BAWAH, kemudian kotak kayu diberi penyangga (kayu) untuk menjaga agar botol tetap menghadap ke atas. Dapat juga digunakan wadah dari metal dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran sampel tersebut. Bungkus wadah tersebut dan cantumkan alamat yang dituju dengan jelas.

Pengiriman specimen dilakukan dengan memperhatikan sungguh-sungguh syarat pengiriman specimen. Spesimen dikirim dengan surat pengantar.

PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI AIR

PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI AIR

PENDAHULUAN

Kualitas air digunakan masyarakat harus memenuhi syarat kesehatan, agar dapat terhindar dari berbagai penyakit maupun gangguan kesehatan yang dapat disebabkan oleh air. Untuk mengetahui kualitas air dimaksud, perlu dilakukan pemeriksaan laboratorium yang mencakup antara lain pemeriksaan Bakteriologi air. Pemeriksaan Bakteriologi air meliputi pemeriksaan Most Probable Number (MPN) dan angka kuman. Pemeriksaan MPN dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air minum, air bersih, air badan air, air permandian umum, air kolam renang, dan pemeriksaan angka kuman dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air kolam renang.

A.    PEMERIKSAAN MOST PROBABLE NUMBER (MPN)

I.       Bahan Pemeriksan    : Air minum, air bersih, air badan air, air permandian umum, air kolam renang.

II.    Persiapan Wadah

a.       Untuk sampel berasal dari keran:

Siapkan wadah botol berukuran 250 ml, isi dengan 5 tetes cairan Sodium Thiosulfate 10%, kemudian botol ditutup.

b.      Untuk sampel air sumur:

Tanpa pemberian Sodium Thiosulfate, pada bagian dasar botol diberi pemberat yang diikatkan dengan kawat. Pada leher botol diikatkan tali dengan panjang 20 meter.

c.       Untuk sampel air dari sumber air yang terbuka, seperti sungai, danau, dll:

Sediakan wadah botol berukuran 250 ml tanpa pemberian Sodium Thiosulfate.

d.      Sebelum disterilisasi, semua botol (beserta tali dan pemberatnya) dibungkus dengan kertas coklat atau kertas timah, dan diikat dengan benang.

e.       Sterilisasi dalam autoclave selama 30 menit pada suhu 120˚C dengan tekanan 1 atmosfir.

III. Alat-alat, media dan reagensia

Alat-alat yang diperlukan                     :

1.      Oven

2.      Autoclave

3.      Incubator

4.      Waterbath

5.      pH meter

6.      Timbangan

7.      Water deionizer

8.      Botol dilusi

9.      Pipet (1 dan 10 ml)

10.  Api gas

11.  Tabung reaksi 16 x 160 mm yang didalamnya berisi tabung durham dengan posisi terbalik

12.  Rak tabung

13.  Ose

14.  Peralatan laboratorium umum: botol erlemnmeyer, beaker glass.

Media dan reagensia yang diperlukan :

§  10% Sodium Thiosulfate

§  70% ethanol

§  Lactose broth

§  Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB)

IV. Pembuatan media

1.      Lactose Broth Single Strength

Komposisi             :

·         Beef extract          3,0 gr

·         Lactose                  5,0 gr

·         Pepton                   5,0 gr

·         Aquadest               1 liter

Cara Pembuatan    :

a.       Larutkan bahan-bahan tersebut di atas, campur hingga larut

b.      Masukkan sebanyak 10 cc ke dalam tabung pembiakan yang berisi tabung Durham dalam posisi terbalik

c.       Tutup dengan tutup karet/kapas

d.      Sterilisasi dalam autoclave pada suhu 121˚C selama 15 menit

pH setelah sterilisasi ± 6,9.

Catatan : Untuk lactose broth double strength sama diatas, hanya   penimbangannya 2 kali lipat/double.

2.      Brilliant Green Lactose Bile Broth

Komposisi             :

·         Pepton from meat                         10 gr

·         Oxbile dried                      20 gr

·         Aquadest                           1 liter

·         Lactose                              10 gr

·         Brilliant B Green               0,0133 gr

·         Aquadest                           1 liter

Cara Pembuatan    :

a.       Larutkan bahan-bahan tersebut di atas, campur hingga larut

b.      Masukkan sebanyak 10 cc ke dalam tabung pembiakaan yang berisi tabung durham dalam posisi terbalik

c.       Tutup dengan karet/kapas

d.      Sterilisasi dalam autoclave pada suhu 121˚C selama 15 menit

pH setelah sterilisasi ± 7,2.